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高效液相色譜法測定大氣顆粒物中的雜環胺
摘要：在烹調富含蛋白質的食物時,蛋白質的降解產物——色氨酸和穀氨酸首先形成一組多環芳胺化合物,如色胺熱解產物(Trp-p-1和Trp-p-2)和穀胺熱解產物(Glu-p-l).致畸研究發現,色胺和穀胺的熱解產物對大鼠,倉鼠和小鼠動物均有致突變性。
建立了大氣顆粒物中雜環胺的高效液相色譜檢測方法。采用ODSC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，乙腈?0.01mol/L三乙胺緩衝溶液(pH4.0)為流動相，非線性梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫30℃，紫外檢測波長263nm，並優化熒光激發和發射波長條件，實現了6種雜環胺的基線分離和4種雜環胺的高靈敏度熒光檢測。本方法中熒光和紫外檢測器的檢出限分別為0.0018～0.0084mg/L和0.093～0.609mg/L(S/N=3)，相關係數在0.9920～0.9999之間，RSD小於5.9%，平均回收率為75.3%～111.6%，回收率相對標準偏差為1.7%～2.3%，具有較高的精確度和準確度。
【關鍵詞】雜環胺，高效液相色譜法，大氣顆粒物
1引言
雜環胺(Heterocyclicamines，HAs)是一類在肉類、家禽、魚類等食物烹調加工時產生的具有致突變性和致癌性的化合物[1]。其致癌性比黃曲黴毒素、亞硝酸胺高幾十倍，也遠高於苯並(a)芘(BaP)。大多數雜環胺已被證明可致實驗動物多種器官的癌變(如肝癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、皮膚癌、口腔癌和胃癌等)[2]。國外自20世紀70年代開始陸續出現雜環胺的研究報道，多集於食物方麵[3～5]，並且已從烹調食品中分離鑒定了近20種雜環胺，但含量極低(以ng/g計)[5]。文獻[6～8]報道，HAs還存在於大氣顆粒物、雨水、土壤、香煙煙霧、柴油機排放顆粒物、垃圾處理廠焚燒的飛灰中，這些事實充分說明這類物質可能是普遍存在的環境汙染物，並由各種物質如食物、垃圾、木材、草、石油等燃燒形成。隨著人們對環境中致突變和致癌性物質健康效應和環境效應的逐漸關注，HAs的形成及影響因素[9]、暴露水平及評價[10]、生物標誌物[11,12]、生物活性[13]、作用機理[14,15]、降解與活化[16]等各方麵的研究日益深入。
為了評價HAs對人類的潛在危險性，分離和檢測食品和環境樣品中的HAs非常重要。鑒於樣品的複雜成分及HAs的痕量水平，通過色譜技術進行分析成為了較好的研究手段。目前，對HAs研究的方法主要有氣相色譜?質譜法(GC?MS)、液相色譜?質譜法(LC?MS)和高效液相色譜法(HPLC)等[17,18]。GC?MS被認為是分析HAs最靈敏的技術，但是許多雜環胺屬極性、難揮發的物質，需要衍生為低極性化合物才利於吸收，而目前提出的酰基化、烷基化、矽烷化等衍生化技術大多處於發展階段[19]，限製了該方法的推廣。LC?MS已成功應用於大多數HAs的檢測，但LC?MS需要繁雜和/或昂貴的儀器，許多實驗室達不到要求，故也有用液相色譜?熒光光譜法(LC?FL)[20]和液相色譜?電化學法(LC?ED)[21]分析HAs的研究報道。相比較而言，HPLC成為分析HAs的較為理想的檢測手段。因所有HAs都具有紫外吸收光譜和電化學氧化性，一部分還有熒光特性，可用紫外(UV)、電化學(ED)或熒光(FL)檢測器進行檢測[22,23]。雜環胺的大多數定量分析方法是基於HPLC?UV，對於具有熒光的HAs，采用FL和UV聯用，有助於排除幹擾，提高定性分析的準確性。
我國自20世紀80年代開展了食物中HAs的研究，但僅有極少報道[24,25]，而對於環境樣品中HAs的分析一直處於空白階段。本研究利用高效液相色譜?熒光?紫外串聯技術對已報道在環境樣品中含量較高的6種HAs進行了分析，建立了快速、簡便、準確檢測大氣顆粒物PM10中HAs的高效液相色譜法，為開展雜環胺的相關研究提供了參考。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
Aglient1100型高效液相色譜儀、紫外檢測器(VWD)和熒光檢測器(FLD)、Agilent化學色譜工作站(美國Aglient公司);pH?3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠);十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司);RE?52A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。
6種雜環胺(純度>99%，加拿大TorontoResearchChemicals公司)，其名稱、結構及美國化學文摘服務登陸號(CAS)見表1;乙腈、二氯甲烷、三乙胺(TEA)和H3PO4(色譜純，美國DimaTechnology公司);正己烷、甲醇及三氯甲烷(北京化工廠);Al2O3(100～120目，在馬弗爐中400℃烘4h)和層析矽膠(60～80目，在馬弗爐中150℃烘4h)為分析純。水為二次蒸餾水。表1雜環胺標樣的名稱、分子量及結構
2.2樣品采集與前處理
樣品采集使用PM10?PM2.5型顆粒物采樣器(北京迪克機電技術有限公司)，校正流速77.49L/min，流量誤差≤5%，采樣時間72h，檢出限為0.09μg/m3。采樣用的玻璃纖維濾膜(Φ90mm，使用前於馬弗爐500℃灼燒2h)在采樣前後用天平準確稱量，質量差即為顆粒物重量，然後濾膜放入冰箱避光、冷凍(-20℃)保存。
大氣顆粒物中有機質的提取參照文獻[26]並加以改進。將采樣濾膜用二次精餾的三氯甲烷索氏抽提72h，提取液濃縮至4mL左右，轉移，吹幹，放入幹燥器中幹燥並恒重，然後添加正己烷濾去不溶的瀝青質。濾液濃縮後移至矽膠?Al2O3層析柱中，分別用正己烷、正己烷?二氯甲烷(1∶2，V/V)、乙醇?三氯甲烷依次衝淋出飽和烴、芳烴和非烴組分。各組分進一步濃縮、吹幹，於-20℃冷凍保存。
野外空白和實驗室係統空白中主要汙染物為鄰苯二甲酸酯，但不影響待測物的分析。
2.3溶液配製
精密稱取6種HAs標準品各1.0mg，分別用乙腈溶解定容至10mL，配成濃度為0.1g/L標準儲備液，將儲備液采用逐級稀釋法配成一係列濃度的混合標樣。用二次蒸餾水將1.39mL三乙胺定容至1000mL，並用H3PO4調節pH值。將冷凍保存的非烴樣品取出，放置至室溫，用1mL乙腈溶解，配製成一定濃度的溶液，待上機分析。
2.4色譜條件
AglientODSC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);流動相A為乙腈，流動相B為0.01mol/L三乙胺(H3PO4調節pH=4.0)緩衝液，非線性梯度淋洗，優化後的梯度淋洗程序見表2。柱溫：30℃;流速：1mL/min;進樣體積：20μL。紫外檢測波長：263nm。表2梯度洗脫程序
3結果與討論
3.1色譜條件的確定
3.1.1流動相的選擇采用乙腈?0.01mol/L三乙胺(H3PO4調節pH=3.4)為二元流動相。向流動相中加入少許堿性物質(三乙胺)，可消除拖尾影響，縮短保留時間，提高譜峰的對稱性。考察了V(乙腈)∶V(H3PO4?三乙胺)=5∶95，10∶90，20∶80，30∶70，40∶60及50∶50的情況。隨著乙腈比例提高，保留時間縮短，峰形得到改善，但6種HAs無法分離;而當配比低於10∶90時，主峰變寬，分離效果下降。鑒於6種HAs化學結構、性質以及在色譜柱中的保留時間相近，確定非線性梯度淋洗，優化後的梯度淋洗程序見表2，在此條件下AαC和MeAαC已完全分離，IQ與MeIQ基本分離(分離度R=1.91)，PhIP和Trp?P?2未完全分離，但已獲得較好分離效果，故以此條件作為下一步實驗的基礎。
3.1.2pH值的選擇將H3PO4?TEA緩衝溶液的pH值分別設為3.0，3.4，3.8，4.0和4.4，結果表明：當pH=3.0時，各HAs的保留時間前移，較低的pH值有助於減小氨基化合物與矽膠表麵矽羥基的作用，使峰形更尖銳。在此情況下，IQ與MeIQ的分離度為1.68，但PhIP和Trp?P?2不能有效分離，在FLD上合為一個峰。逐步提高pH值，PhIP和Trp?P?2間分離度增大(表3)。當pH=4.4時，PhIP和Trp?P?2已達到完全基線分離，但各峰的峰形變寬，靈敏度下降。綜合考慮，選擇pH=4.0的H3PO4?TEA緩衝溶液。表3pH值對PhIP和Trp?P?2分離的影響
3.1.3流動相流速的選擇流動相的流速對各物質的保留時間有較大影響。分別設定流速為0.5，1.0和1.5mL/min。結果表明，隨著流速增加，柱壓增高，保留時間縮短，但分離度降低。綜合考慮分離度、保留時間和峰形等因素，流動相的流速定為1.0mL/min，6種物質在20min內即可完成分離。
3.1.4檢測波長的選擇由於IQ與MeIQ不能發射熒光，而其它4種HAs能夠發射熒光，故采用熒光?紫外串聯檢測，保證6種組分均能定量分析，同時雙檢測器有助於排除幹擾，提高準確性。經反複實驗，確定紫外檢測波長為263nm，並優化了PhIP，Trp?P?2，AαC和MeAαC的熒光激發波長和發射波長。
3.1.5其它條件的選擇在優化的色譜條件下，選擇柱溫30℃，進樣量20μL，得到HAs標準品的色譜圖(圖1)。結果表明，本研究建立的HPLC?VWD?FLD檢測方法采用梯度條件進行洗脫，程序波長熒光檢測器進行檢測，使6種HAs獲得良好的分離，並且出峰時間短，尤其是FLD檢測的峰形尖銳，對稱性好。
3.2標準曲線及線性關係
將6種HAs標準儲備液配製成0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和15.0mg/L係列濃度的混合標準溶液，在確定的色譜條件下進樣，以HAs峰麵積(A)對濃度(c)進行線性回歸，得到6種HAs的標準工作曲線、相關係數、線性範圍(表5)。從表5看出，6種HAs的相關係數都均大於0.9920，說明熒光檢測器、紫外檢測器在線性範圍內峰麵積與濃度有良好的相關性，可滿足定量分析的需要。表5HAs的線性回歸方程、相關係數及線性範圍。
3.3檢出限、精密度和回收率
以S/N=3對應濃度作為儀器檢出限;取0.5，1.0和5.0mg/L3個濃度水平的HAs混標分別重複進樣5次，計算相對標準偏差(RSD)。取同一大氣顆粒物樣品2份，一份直接測定，另一份添加適當濃度的6種HAs混標後測定各成分含量，每份樣品平行測定3次，考察方法的回收率，結果見表6。從表6可見，PhIP，Trp?P?2，AαC和MeAαC在熒光檢測器的檢出限(0.0018～0.0084mg/L)低於紫外檢測器檢出限(0.093～0.609mg/L)幾個數量級。各HAs的相對標準偏差(RSD)均小於5.9%，說明本方法的重複性較好。平均加標回收率為75.3%～111.6%，回收率相對標準偏差為1.7%～2.3%，具有較高的準確度。表6儀器檢出限、精密度和回收率。
3.4實際樣品分析
在上述色譜條件下，對北京大氣顆粒物PM10樣品中的非烴進行檢測，結果見表7。由表7可見，不同采樣點大氣顆粒物樣品中HAs的含量及各組分的分布均有差異。本方法靈敏、準確、可靠，適用於大氣中痕量HAs的分析，對開展HAs的研究具有一定意義。表7樣品測定結果。
(來源：中國化工儀器網)